commande d'amorces inverses

1. Comment commander des amorces inversées?
2. Comment choisissez-vous les amorces avant et arrière?
3. Comment lisez-vous un amorce inverse?
4. Comment choisir une amorce pour le séquençage?
5. Quel est l'amorce inverse?
6. Avez-vous besoin d'amorces avant et arrière pour le séquençage?
7. Pourquoi avez-vous besoin d'amorces directes et inverses dans la PCR?
8. Comment concevoir manuellement un apprêt?
9. Pourquoi différents apprêts nécessitent-ils des températures de recuit différentes??
10. Qu'est-ce que le complément inverse?
11. Les amorces PCR devraient-elles être complémentaires les unes des autres?
12. Les amorces doivent-elles avoir la même longueur?

Comment commander des amorces inversées?

Pour une amorce inverse: écrivez la séquence complémentaire de l'extrémité 3 'de la matrice sens, inversez-la, de sorte qu'elle puisse être lue comme 5'-3' et ajoutez toute séquence supplémentaire à l'extrémité 5 'de cette amorce. Ainsi, pour l'exemple donné ci-dessus, le mode 5'-3 'de l'amorce inverse sera: 5'-NNNNNNNNNN-CTCTAGAATCCTCAA-3'. C'est facile, n'est-ce pas?

Comment choisissez-vous les amorces avant et arrière?

Les amorces directe et inverse doivent être distantes d'environ 500 pb. L'extrémité 3 'de l'amorce doit être un G ou un C. La séquence génomique qui provient de l'ordinateur est juste un brin; le brin complémentaire n'est pas représenté. Pour l'amorce avant, vous pouvez utiliser la séquence directement.

Comment lisez-vous un amorce inverse?

Parce que les amorces sont lues et créées par les humains, notre amorce inverse doit être écrite du début à la fin. C'est ce qu'on appelle le «complément inverse» du brin supérieur. Les 4 bases qui se lient au 3 'du brin supérieur sont TCGC. Mais rappelez-vous que l'amorce commence à l'extrémité 3 ', il doit donc être lu comme CGCT.

Comment choisir une amorce pour le séquençage?

Voici quelques points à garder à l'esprit lors de la conception de vos propres apprêts.

1. La longueur de l'apprêt doit être comprise entre 18 et 22 bases.
2. L'amorce doit avoir une teneur en GC de 50% à 55%.
3. Les amorces doivent avoir un verrou GC à l'extrémité 3 '.
4. La température de fusion de tout bon apprêt doit être comprise entre 50 ° C et 55 ° C.

Quel est l'amorce inverse?

Les amorces sont de courtes séquences d'ADN simple brin qui marquent les deux extrémités de la séquence cible. ... L'amorce sens se fixe au codon de départ de l'ADN matrice (le brin anti-sens), tandis que l'amorce inverse se fixe au codon d'arrêt du brin complémentaire d'ADN (le brin sens).

Avez-vous besoin d'amorces avant et arrière pour le séquençage?

Habituellement, l'amorce directe ou inverse utilisée pour la réaction de PCR peut être utilisée dans la réaction de séquençage. ... Nous recommandons deux réactions de séquençage pour chaque fragment d'intérêt afin d'assurer un séquençage double brin du fragment. L'analyse des données n'est pas complètement précise pour les 25 premières et dernières bases de la séquence.

Pourquoi avez-vous besoin d'amorces directes et inverses dans la PCR?

Deux amorces, amorce directe et amorce inverse, sont utilisées dans chaque réaction de PCR, qui sont conçues pour flanquer la région cible pour l'amplification. ... L'amorce sens se lie à l'ADN matrice, tandis que l'amorce inverse se lie à l'autre brin complémentaire, tous deux amplifiés dans la réaction de PCR.

Comment concevoir manuellement un apprêt?

Compte tenu des informations ci-dessus, les amorces doivent généralement avoir les propriétés suivantes:

1. Longueur de 18-24 bases.
2. Contenu 40-60% G / C.
3. Commencez et terminez avec 1-2 paires G / C.
4. Température de fusion (Tm) de 50-60 ° C.
5. Les paires d'amorces doivent avoir une Tm à moins de 5 ° C l'une de l'autre.
6. Les paires d'amorces ne doivent pas avoir de régions complémentaires.

Pourquoi différents apprêts nécessitent-ils des températures de recuit différentes??

À basse température, une correspondance partielle entre l'amorce et le modèle sera suffisamment stable et vous obtiendrez une amplification à partir de plus d'endroits. Plus la température est élevée, plus l'amorce nécessite une séquence compatible plus longue pour se lier et, par conséquent, votre spécificité sera plus élevée.

Qu'est-ce que le complément inverse?

Complément inversé. Le complément inverse convertit une séquence d'ADN en son homologue inverse, complémentaire ou inverse. Vous voudrez peut-être travailler avec le complément inverse d'une séquence s'il contient un ORF sur le brin inverse. Collez la séquence brute ou FASTA dans la zone de texte ci-dessous.

Les amorces PCR devraient-elles être complémentaires les unes des autres?

NON! Les deux amorces utilisées dans la PCR ne doivent pas être complémentaires, sinon elles s'hybrideront et formeront un «dimère d'amorce». Si un dimère d'amorce est présent dans la réaction de PCR, l'ADN polymérase pourrait amplifier le dimère d'amorce, qui consomme des réactifs de PCR et inhibe potentiellement l'amplification de l'ADN cible.

Les amorces doivent-elles avoir la même longueur?

1. Longueur des amorces: Il est généralement admis que la longueur optimale des amorces PCR est de 18 à 22 pb. Cette longueur est suffisamment longue pour une spécificité adéquate et suffisamment courte pour que les amorces se lient facilement à la matrice à la température d'hybridation.