défis dans l'extraction d'ARN

Guide de dépannage pour l'extraction d'ARN total & Purification

1. Quelles sont les causes de la dégradation de l'ARN?
2. Comment améliorer l'extraction de l'ARN?
3. Pourquoi l'ARN est-il plus difficile à extraire que l'ADN?
4. Comment éviter la contamination de l'ADN lors de l'isolement de l'ARN?
5. Comment pouvons-nous protéger l'ARN de la dégradation?
6. L'autoclavage détruit-il l'ARN?
7. Comment congeler des cellules pour l'extraction d'ARN?
8. Comment se débarrasser de l'ARN?
9. Comment fonctionne l'extraction d'ARN?
10. Pourquoi l'azote liquide est utilisé dans l'extraction d'ARN?
11. Quel est le but de l'extraction d'ARN?
12. Qu'est-ce qu'un bon rendement en ARN?

Quelles sont les causes de la dégradation de l'ARN?

Il y a deux raisons principales pour la dégradation de l'ARN lors de l'analyse de l'ARN. Premièrement, l'ARN, de par sa structure même, est intrinsèquement plus faible que l'ADN. ... Cela rend l'ARN plus chimiquement labile que l'ADN. L'ARN est également plus sujet à la dégradation thermique que l'ADN.

Comment améliorer l'extraction de l'ARN?

Il existe 3 méthodes efficaces pour y parvenir:

1. Homogénéiser soigneusement les échantillons immédiatement après la récolte dans une solution de lyse cellulaire à base chaotropique (par exemple, contenant du guanidinium) comme le tampon de lyse disponible dans le kit PureLink RNA Mini ou le réactif TRIzol.
2. Échantillons de congélation éclair dans de l'azote liquide.

Pourquoi l'ARN est-il plus difficile à extraire que l'ADN?

La raison principale est que l'ARN est moins stable et plus facile à dégrader que l'ADN. ... L'ARN a des rainures plus larges que l'ADN, ce qui facilite l'attaque des enzymes. Les enzymes qui dégradent l'ARN, les ribonucléases (RNases) sont abondantes dans l'environnement et difficiles à éliminer complètement.

Comment éviter la contamination de l'ADN lors de l'isolement de l'ARN?

Le problème peut parfois être évité en contraignant les amorces à traverser les limites des introns, mais cela est souvent difficile et les méthodes actuellement utilisées pour réduire la contamination de l'ADN comprennent la digestion DNAse I, le fractionnement sur gel, le phénol acide: extraction au chloroforme et la précipitation au chlorure de lithium..

Comment pouvons-nous protéger l'ARN de la dégradation?

Afin d'éviter la dégradation, les échantillons d'ARN sont généralement conservés congelés à -20 ° C ou -80 ° C ou sous azote liquide.

L'autoclavage détruit-il l'ARN?

Assurez-vous de séparer les réactifs utilisés pour le travail sur l'ARN des «réactifs à usage général» dans le laboratoire. Toutes les solutions, à l'exception des tampons Tris, doivent être traitées avec 0,1% de DEPC (ou DMPC) pendant une nuit à température ambiante, puis autoclavées. L'autoclavage hydrolyse et détruit le DEPC et le DMPC n'ayant pas réagi.

Comment congeler des cellules pour l'extraction d'ARN?

Placer le tissu dans un tube de microfuge de 1,5 ml ou 15 ml conique et congeler instantanément sur de la glace sèche. Vous pouvez également envelopper le tissu dans du papier d'aluminium et le congeler avec de l'azote liquide.

Comment se débarrasser de l'ARN?

La contamination par l'ARN peut être éliminée en ajoutant 2 microlitre de RNase A (10 mg / ml, Fermentas) à 20 microlitre d'ADN dissous dans du tampon TE (Tris – EDTA, pH = 8,0) et incuber pendant 3-4 h à 37 C.

Comment fonctionne l'extraction d'ARN?

Méthodes d'extraction organique

Lors de la centrifugation, l'échantillon se sépare en trois phases: une phase organique inférieure, une phase intermédiaire contenant des protéines dénaturées et de l'ADNg et une phase aqueuse supérieure contenant de l'ARN. La phase aqueuse supérieure est récupérée et l'ARN est collecté par précipitation alcoolique et réhydratation.

Pourquoi l'azote liquide est utilisé dans l'extraction d'ARN?

L'azote liquide est utilisé car il a une température très basse de -176 ° C qui aide à pulvériser la substance dure des tissus végétaux et animaux pour se transformer en poussière. Il aide également à désactiver la DNAase pour digérer l'ADN .

Quel est le but de l'extraction d'ARN?

L'extraction d'ARN est la purification de l'ARN à partir d'échantillons biologiques. Cette procédure est compliquée par la présence omniprésente d'enzymes ribonucléases dans les cellules et les tissus, qui peuvent rapidement dégrader l'ARN.

Qu'est-ce qu'un bon rendement en ARN?

Un A₂₆₀/UNE₂₈₀ un rapport supérieur à 1,8 est généralement considéré comme un indicateur acceptable d'un ARN de bonne qualité avec un faible niveau de contamination protéique [14, 15]. Un A₂₆₀/UNE₂₃₀ un rapport supérieur à 1,8 est utilisé comme indicateur de l'ARN extrait avec un faible niveau de contamination par les polysaccharides.