problème de double digest de mappage de restriction

1. Pourquoi y a-t-il des restrictions de double digestion?
2. Pourquoi mon résumé des restrictions ne fonctionne-t-il pas?
3. Que se passe-t-il si vous ajoutez trop d'enzyme de restriction?
4. Deux enzymes de restriction peuvent-elles couper au même site?
5. Comment calculer le résumé des restrictions?
6. Combien de temps devrait prendre un résumé de restriction?
7. L'inactivation par la chaleur des enzymes de restriction est-elle nécessaire?
8. Les enzymes de restriction expirent-elles?
9. Comment empêcher la digestion des restrictions?
10. Pourquoi une enzyme de restriction ne couperait-elle pas?
11. Comment sélectionnez-vous les enzymes de restriction?
12. Pourquoi les enzymes de restriction doivent-elles être conservées sur de la glace??

Pourquoi y a-t-il des restrictions de double digestion?

La digestion simultanée d'un substrat d'ADN avec deux endonucléases de restriction (double digestion) est une procédure courante qui permet de gagner du temps. La sélection du meilleur NEBuffer pour fournir des conditions de réaction qui optimisent l'activité enzymatique et évitent l'activité en étoile associée à certaines enzymes est une considération importante.

Pourquoi mon résumé des restrictions ne fonctionne-t-il pas?

Digestion incomplète ou inexistante en raison de l'activité enzymatique bloquée par la méthylation de l'ADN. Si votre enzyme est active et digère l'ADN de contrôle et que la réaction est mise en place dans des conditions optimales, mais que vous constatez toujours des problèmes de digestion, cela peut être dû au fait que l'enzyme est inhibée par la méthylation de l'ADN matrice..

Que se passe-t-il si vous ajoutez trop d'enzyme de restriction?

Une digestion incomplète peut se produire lorsque trop ou pas assez d'enzyme est utilisée. La présence de contaminants dans l'échantillon d'ADN peut inhiber les enzymes, entraînant également une digestion incomplète.

Deux enzymes de restriction peuvent-elles couper au même site?

Vous pouvez faire avec des contrôles appropriés comme la digestion par restriction unique et les deux enzymes ensemble pour vous assurer que les deux coupent indépendamment et ensemble et poursuivez vos plans. Malheureusement, j'étais limité à ces deux enzymes qui avaient des sites côte à côte!

Comment calculer le résumé des restrictions?

Calculez la quantité de chacun que vous devez ajouter à une digestion de restriction afin de digérer 5ug (5000ng) d'ADN avec 5 unités d'enzyme. Par exemple si mon ADN est à 190 ng / ul, j'aurais besoin de: 5000ng / 190ng / ul = 26 ul de mon échantillon.

Combien de temps devrait prendre un résumé de restriction?

* Pro-Tip * Selon l'application et la quantité d'ADN dans la réaction, le temps d'incubation peut varier de 45 minutes à une nuit. Pour les digestions diagnostiques, 1 à 2 heures est souvent suffisante. Pour les résumés avec >1 µg d'ADN utilisé pour le clonage, il est recommandé de digérer pendant au moins 4 heures.

L'inactivation par la chaleur des enzymes de restriction est-elle nécessaire?

FAQ: Est-il nécessaire de désactiver les enzymes de restriction après la digestion du vecteur? L'inactivation des endonucléases de restriction n'est généralement pas nécessaire, mais dans certains cas, elle peut augmenter l'efficacité de la transformation.

Les enzymes de restriction expirent-elles?

L'activité de toutes les enzymes est testée tous les 3 à 6 mois; la date de péremption est indiquée sur l'étiquette attachée à chaque flacon d'enzyme. Après trente-cinq ans d'expérience avec les enzymes de restriction, nous avons constaté que la plupart sont très stables lorsqu'ils sont conservés à -20 ° C dans le tampon de stockage recommandé..

Comment éviter la digestion par restriction?

Protocole de restriction enzymatique Digest

1. Ajoutez les composants à un tube propre dans l'ordre indiqué: ...
2. Incuber la réaction à la température de digestion (généralement 37 ° C) pendant 1 heure.
3. Arrêter la digestion par inactivation thermique (65 ° C pendant 15 minutes) ou ajout de 10 mM de concentration finale d'EDTA.
4. L'ADN digéré est prêt à être utilisé dans des applications de recherche.

Pourquoi une enzyme de restriction ne couperait-elle pas?

FAQ: Pourquoi mon enzyme de restriction ne coupe-t-il pas l'ADN? ... Si l'ADN de contrôle est clivé et que l'ADN expérimental résiste au clivage, les deux ADN peuvent être mélangés pour déterminer si un inhibiteur est présent dans l'échantillon expérimental. Si un inhibiteur (souvent du sel, de l'EDTA ou du phénol) est présent, l'ADN témoin ne se coupera pas après le mélange.

Comment sélectionnez-vous les enzymes de restriction?

Lors de la sélection des enzymes de restriction, vous voulez choisir des enzymes qui:

1. Flanquez votre insert, mais ne coupez pas à l'intérieur de votre insert.
2. Se trouvent à l'emplacement souhaité dans votre plasmide receveur (généralement dans le site de clonage multiple (MCS)), mais ne coupez pas ailleurs sur le plasmide.

Pourquoi les enzymes de restriction doivent-elles être conservées sur de la glace??

Les enzymes doivent-elles vraiment être conservées sur de la glace tout le temps? ... Les enzymes doivent être stockées et utilisées à leurs températures optimales. Les enzymes sont généralement stockées dans du glycérol à -20 ° C. Cela les empêche de geler complètement, ce qui entraîne une dénaturation des protéines et une perte d'activité.